Použitie destilovanej vody pri detekcii baktériovej krúžkovitosti zemiaka

Baktériová krúžkovitosť zemiaka, spôsobená baktériou Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, je vážne ochorenie, ktoré môže spôsobiť značné straty v úrode zemiakov. Včasná a presná detekcia tejto baktérie je kľúčová pre zabránenie šíreniu ochorenia. Destilovaná voda zohráva dôležitú úlohu v rôznych fázach diagnostiky a kontroly baktériovej krúžkovitosti zemiaka.

V tomto článku sa zameriame na to, ako sa destilovaná voda používa pri testovaní a prevencii tohto ochorenia, pričom sa opierame o nariadenia a postupy stanovené Ministerstvom pôdohospodárstva Slovenskej republiky.

Podozrenie na výskyt Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus si vyžaduje druhý skríningový test. Ak je však prvý test negatívny, vzorka sa považuje za negatívnu. Ak aj druhý alebo ďalšie testy sú negatívne, vzorka sa považuje za negatívnu.

Pozitívny výskyt podľa § 3 ods. a testovanie podľa schémy musí pokračovať. Pozitívna reakcia na IF test podľa § 3 ods. podľa systému musí pokračovať. Potvrdená prítomnosť podľa § 4 ods. čistej kultúry Clavibacter michiganensis ssp.

Príprava vzoriek a extrakcia

Pri príprave vzoriek zemiakov na testovanie je dôležité zabezpečiť, aby boli extrakty vzoriek zbavené pôdy. Na extrakciu DNA sa používa metóda podľa Pastrika (2000):

1. Vzorka sa vloží do 1,5 ml Eppendorfovej skúmavky.
2. Zahrieva sa v bloku alebo vodnom kúpeli s teplotou 95 stupňov C na 10 minút.
3. Následne sa ochladí na ľade na päť minút.
4. Pridá sa chloroform a vzorka sa centrifuguje 30 minút.
5. Supernatant sa prenesie do novej skúmavky, pridá sa izopropanol, pretrepe sa a inkubuje sa pri teplote 65 stupňov C počas 30 minút.
6. Vzorka sa centrifuguje a etanol sa odstráni vákuovým odsávaním.
7. Pelet sa suší pri izbovej teplote počas najmenej 20 minút.
8. Nakoniec sa resuspenduje v redestilovanej vode a uchováva sa pri -20 stupňov C, až kým sa nebude požadovať pre PCR.

Uplatniť možno aj iné metódy extrakcie DNA.

Štandardná veľkosť vzorky je 200 hľúz na každý test. Príliš veľké množstvo zemiakov vo vzorke povedie k inhibícii alebo zložitej interpretácii výsledkov. Je potrebné zabrániť prenosu DNA na nádobách alebo drviacom zariadení. Použili čerstvo sterilizované čepele mixéra a nádoby.

Postup prípravy vzorky:

• Odstráni sa šupka hľuzy na jej pupkovom konci, aby bolo vidieť cievne pletivo.
• Hľuzy sa nechajú na vzduchu vyschnúť.
• dôkladne vyčistiť a dezinfikovať pomocou chlórových zlúčenín).
• (napr. vrecúšku (napr. homogenizujú pomocou mixéra.
• Dekantuje sa supernatant.

Pelet sa resuspenduje v peletovom tlmivom roztoku. Použije sa 500 mikrol na test pre Clavibacter michiganensis ssp., 500 mikrol na test pre Ralstonia solanacearum a 500 mikrol na archiváciu. pri teplote -68 až -86 stupňov C (niekoľko mesiacov). Clavibacter michiganensis ssp. kontaminácii.

Okrem hľúz sa môžu testovať aj časti stoniek. Pri testovaní stoniek sa uplatniť na kompozitné vzorky až do množstva 200 častí stonky.

1. najnižší postranný výhonok z každej rastliny.
2. nad úrovňou zeminy.
3. Pri S. burinného hostiteľa na jedno miesto odberu.

Po macerácii sa čistá alebo koncentrovaná vzorka rozdelí na dve rovnaké diely.

Obrázok 1: Schéma testovania vzoriek stoniek

Použitie destilovanej vody v testoch

Destilovaná voda je nevyhnutná pri príprave rôznych roztokov a pufrov používaných v diagnostických testoch. Príkladom je príprava tlmivých roztokov na extrakciu:

• Tlmivý roztok na extrakciu: Používa sa 0,1 M fosfátový tlmivý roztok, pH 7,0.
• Peletový tlmivý roztok: Používa sa 0,01 M fosfátový tlmivý roztok, 0,85 % NaCl, pH 7,2.

Imunofluorescenčný test (IF)

Imunofluorescenčný test (IF) je skríningový test na detekciu Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Pri tomto teste sa destilovaná voda používa na prípravu tlmivých roztokov a na riedenie protilátok. Test sa robí s čerstvo pripravenými extraktmi zo vzoriek.

Postup:

1. Pripraví sa sada dvojnásobných riedení protilátky v pufri IF.
2. Podložné sklíčka sa uložia na vlhký papier.
3. Jamky sa úplne pokryjú riedeniami protilátky.
4. Podložné sklíčka sa položia na vlhký papier.

Počas testu sa hodnotí fluorescencia buniek pod mikroskopom. bunky s charakteristickou morfológiou Clavibacter michiganensis ssp. pri rovnakom riedení protilátky.

PCR testovanie

PCR testovanie je ďalší skríningový test používaný na detekciu Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Destilovaná voda sa používa na prípravu reakčných zmesí a na riedenie vzoriek. Cieľom je zistenie 10na3 až 10na4 buniek Clavibacter michiganensis ssp. Používajú sa validované činidlá a protokoly PCR. ssp. resuspendovaných peletov, ku ktorým sa pridala Clavibacter michiganensis ssp. ssp. sepedonicus na 1 ml redest H2O (napr. Extrakty vzoriek by mali byť zbavené pôdy.

Produkty PCR sa analyzujú agarózovou gélovou elektroforézou. Použije sa príslušný štandard DNA, napr. Gél po sfarbení s etídium bromidom sa pozoruje v UV transiluminátore (? 302 nm) a zdokumentuje sa.

Podmienkou je, že PCR Clavibacter michiganensis ssp. neamplifikuje pri žiadnej z negatívnych kontrol. PCR Clavibacter michiganensis ssp. získa zo vzorky pozitívnej kontroly s obsahom Clavibacter michiganensis ssp. ssp. sepedonicus v zemiakovom extrakte.

FISH testovanie

FISH testovanie (fluorescenčná in situ hybridizácia) je ďalšia metóda, pri ktorej sa používa destilovaná voda na prípravu hybridizačných roztokov. Test FISH (bod 9.4) sa musí zopakovať, ak je sfarbenie odlišné.

bunky s charakteristickou morfológiou Clavibacter michiganensis ssp. pozitívneho kontrolného kmeňa. Pri podozrení na kontamináciu sa test musí zopakovať. So špecifickosťou testu FISH sa spája niekoľko problémov.

Ak bunky vykazujú veľkosťou a morfológiou typickou pre Clavibacter michiganensis ssp. kontrolách, avšak v žiadnej negatívnej kontrole. peletu (dodatok 4). peletu sa považujú za potenciálne kontaminované. Vyžaduje sa ďalšie testovanie.

Izolácia a kultivácia

Pri izolácii a kultivácii Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus sa destilovaná voda používa na prípravu živných médií. Tieto médiá obsahujú agar, živiny a ďalšie prísady potrebné pre rast baktérií. Dôležité je, aby médiá boli sterilné, čo sa dosahuje autoklávovaním s použitím destilovanej vody.

Po naočkovaní sa rastliny začnú pravidelne sledovať symptómy. rastlín, na ktorých sa prejavujú symptómy Clavibacter michiganensis ssp. okrajovým, alebo medzižilovým ochabnutím. tmavozelena alebo sa na nich vytvárajú škvrny, pred odumieraním často blednú. vädnutie má mazľavý vodou nasiaknutý vzhľad. okraje. symptómy, tým vyššia je možnosť prežitia. Rastliny môžu infekciu prekonať. rastliny baklažánu sú aj voči menším populáciám Clavibacter michiganensis ssp. húb, ktoré sú v pletivách hľúz zemiaka prítomné. Erwinia carotovora supsp. carotovora a Erwinia carotovora subsp. exigua var. foveata, ako aj populáciami saprofytických baktérií. symptómom baktériovej krúžkovitosti. infekciách Erwinia chrysanthemi. michiganensis subsp. celých listov alebo celých rastlín. 7.9. alebo tkaniva stonky z rastlín (bod 3.1.3 v súvislosti s maceráciou). a stoniek baklažánu sa dezinfikuje potretím 70-percentným etanolom.

Dezinfekcia

Na prevenciu šírenia ochorenia je nevyhnutná dôkladná dezinfekcia nástrojov, zariadení a priestorov. Destilovaná voda sa používa na prípravu dezinfekčných roztokov a na oplachovanie po dezinfekcii. Dôležité je používať dezinfekčné prostriedky, ktoré sú účinné proti baktériám.

Záver

Destilovaná voda je nenahraditeľnou súčasťou diagnostiky a kontroly baktériovej krúžkovitosti zemiaka. Jej použitie v príprave vzoriek, testovacích roztokov, kultivačných médií a dezinfekčných postupov zaisťuje presnosť a spoľahlivosť výsledkov, čo je kľúčové pre efektívne riadenie tohto ochorenia.

Tabuľka: Prehľad použitia destilovanej vody v diagnostike baktériovej krúžkovitosti zemiaka

tags: #destilovaná #voda #použitie #zemiaky

Populárne príspevky:

• Kysnuté koláče z Riečky
• Nutričné hodnoty tekvice
• Figúrka tanečného páru
• Všetko o liatinovom plechu na gril
• Recenzie ázijských reštaurácií v Nitre